支原體qPCR法檢測(cè)操作過程  

本流程旨在通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)，對(duì)樣本中的支原體（Mycoplasma）DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增與檢測(cè)，以判斷樣本是否受到支原體污染。整個(gè)過程包括樣本處理、DNA提取、qPCR反應(yīng)體系配制、擴(kuò)增程序運(yùn)行及結(jié)果分析。  

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備  

實(shí)驗(yàn)室分區(qū)管理  

遵循“三區(qū)原則”：樣本處理區(qū)、試劑準(zhǔn)備區(qū)、擴(kuò)增與產(chǎn)物分析區(qū)，避免交叉污染。  

各區(qū)域使用專用移液器、耗材和工作服。  

試劑與儀器準(zhǔn)備  

qPCR儀 

離心機(jī)、渦旋振蕩器、微量移液器  

支原體DNA提取試劑盒 

支原體特異性qPCR檢測(cè)試劑盒（含引物、探針、dNTPs、Taq酶、緩沖液等）  

無(wú)菌無(wú)酶PCR管、槍頭  

陽(yáng)性對(duì)照（支原體DNA）、陰性對(duì)照（無(wú)菌水）、內(nèi)參對(duì)照（如18SrRNA，用于檢測(cè)提取效率）  

引物與探針設(shè)計(jì)（若使用自建體系）  

靶基因：常用保守序列如16SrRNA基因或P1黏附蛋白基因。  

探針標(biāo)記：通常為FAM熒光標(biāo)記，淬滅基團(tuán)為BHQ1或TAMRA。  

二、樣本處理與DNA提取  

樣本類型  

細(xì)胞培養(yǎng)上清、血清、尿液、拭子樣本等。  

DNA提取步驟（以液體樣本為例）  

取1mL樣本，13,000rpm離心5分鐘，棄上清。  

沉淀中加入裂解液（BufferATL）和蛋白酶K，56℃水浴孵育1小時(shí)。  

加入乙醇，混勻后轉(zhuǎn)移至DNA純化柱。  

依次用洗滌液（AW1、AW2）洗滌。  

最后用50–100μL無(wú)酶水洗脫DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/div>